Mobilizacja komórek macierzystych za pomocą hiperbarycznego tlenu

Stephen R. Thom,^1,2 Veena M. Bhopale,¹ Omaida C. Velazquez,³ Lee J. Goldstein,³ Lynne H. Thom,¹ and Donald G. Buerk⁴

¹ Instytut Medycyny Środowiskowej i wydziały ² Medycyny Ratunkowej, ³ chirurgii i ⁴ fizjologii, Centrum Medyczne Uniwersytetu w Pensylwanii, Philadelphia, Pensylwania

Streszczenie

Wysunęliśmy hipotezę, iż wystawienie na działanie tlenu hiperbarycznego (HBO₂ ) może zmobilizować komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego poprzez mechanizmu zależny od tlenku azotu (•NO). Populacja komórek CD34⁺ w ludzkim krążeniu obwodowym została podwojona w reakcji na pojedyncze wystawienie na działanie 2,0 atmosfer absolutnych (ATA) O₂ na 2 godziny. Podczas 20 takich działań, ilość cyrkulujących komórek CD34⁺ powiększyła się ośmiokrotnie, chociaż ogólna liczba cyrkulujących białych krwinek nie uległa znacznemu powiększeniu. Liczba komórek tworzących kolonie (CFC) zwiększyła się z 16±2 do 26±3 CFC/100,000 umieszczonych monocytów . Wzrost w liczebności CFC spowodowany był wyłącznie subpopulacją CD34⁺ , lecz wzrost komórek nastąpił jedynie w próbkach pozyskanych natychmiast po zabiegu. Wysoki odsetek komórek potomnych cechuje się receptorami dla czynnika-2 wzrostu śródbłonka naczyń oraz czynnika wzrostu kierowanego podścieliskami. U myszy, HBO₂ zwiększył odsetek cyrkulujących komórek macierzystych o 50%, zwiększył liczbę cyrkulujących komórek cechujących się antygenem-1 komórek macierzystych oraz CD34 3,4-krotnie, jak również podwoił liczbę CFC. stężenie •NO szpiku kostnego zwiększyło się o 1,008±255 nM w związku z HBO₂ . Mobilizacja komórek macierzystych nie nastąpiła u myszy z nokautem genu na śródbłonkową syntezę •NO. Co więcej, przedzabiegowe potraktowanie dzikich myszy inhibitorem syntezy •NO zapobiegło wzrostowi odsetka komórek i cyrkulujących komórek macierzystych wywołanemu HBO₂ . Wyciągamy wniosek, iż HBO₂ mobilizuje komórki macierzyste/ progenitorowe poprzez stymulację syntezy •NO.

Tlenek azotu, CD34; CD133; CXCR4; cKit; komórki tworzące kolonie, komórki progenitorowe

Celem niniejszego badania było określenie, czy wystawienie na działanie tlenu giperbarycznego (HBO₂ ) może zmobilizować dostarczane przez szpik kostny komórki macierzyste/progenitorowe (SPC) u ludzi i zwierząt. Pluripotencjalne SPC u dorosłych wykazują właściwości podobne do SPC u zarodków i dobrze rokują w leczeniu chorób zwyrodnieniowych i dziedzicznych (9, 20). Neowaskularyzacja poporodowa zachodzi poprzez kiełkowanie śródbłonka z istniejących krwinek (angiogeneza) oraz poprzez śródbłonkowe SPC uwalniane ze szpiku kostnego, które przemieszczają się do ognisk niedokrwienia w procesie waskulogenezą (21). Mobilizacja SPC ze szpiku kostnego może być wywołana niedokrwieniem obwodowym, intensywnymi ćwiczeniami ,środkami chemioterapeutycznymi oraz hematopoetycznymi czynnikami wzrostu (2, 16, 22, 23, 27, 30, 36). SPC pozyskać można także drogą bezpośredniego pobierania szpiku kostnego oraz manipulacji ex vivo (10, 28, 32). SPC hematopoetyczne zazwyczaj pozyskuje się w celu przeprowadzenia przeszczepu szpiku kostnego poprzez podanie środków chemioterapeutycznych oraz czynników wzrostu (36).Wykorzystanie tych środków do pozyskania autologicznych SPC do leczenia schorzeń, jak niedokrwienie narządów i kończyn, jak i niegojących się ran, było rozważane, jednak zastosowanie nie było możliwe z powodu ryzyka takich powikłań, jak ostra zakrzepica tętnic, angina, sepsa i śmierć (7, 20, 21, 27, 29, 30, 36).

Tlenek azotu (•NO) odgrywa kluczową rolę z wywoływaniu mobilizacji SPC ze szpiku kostnego poprzez uwalnianie cytokiny z komórkami macierzystymi, liganda cKit (czynnik wzrostu komórek macierzystych, SCF) (1, 8). Ponieważ HBO₂ jest w stanie aktywować syntazę •NO w różnych tkankach, wysunęliśmy hipotezę, że HBO₂ może stymulować mobilizację SPC do krążenia obwodowego (33, 34). W modelu mysim odkryliśmy, że HBO₂ wzmacnia mobilizację oraz rekrutację SPC do ran niedokrwiennych, jak i przyspiesza leczenie tychże ran (Goldstein LJ, Gallagher K, Baireddy V, Bauer SM, Bauer RJ, Buerk DG, Thom SR, Velazquez OC, obserwacje nieopublikowane). Wykazano, że SPC przechodzą do ran niedokrwiennych, gdzie są potrzebne do angiogenezy (3).

Terapia HBO₂ stosowana jest na różne dolegliwości w komorze hiperbarycznej, gdzie pacjenci wdychają czysty O₂ przy ciśnieniach cząstkowych sięgających 3,0 atmosfer absolutnych (ATA). HBO₂ wykorzystywany jest standardowo w leczeniu profilaktycznym celem redukcji występowania osteoradionekrozy (ORN) u pacjentów, którzy muszą przejść operację tkanki, które wcześniej poddano radioterapii (6, 15). Pozyskaliśmy próbki krwi obwodowej od normalnych ludzkich ochotników oraz od grupy pacjentów przyjmujących profilaktycznie HBO₂ przed operacją mającą zredukować ryzyko ORN, po czym zbadaliśmy krew pod kątem występowania SPC. Następnie zbadaliśmy mechanizm mobilizacji SPC u myszy. W niniejszej pracy demonstrujemy, iż HBO₂ powoduje rychłą mobilizację SPC u ludzi oraz u myszy, a dzieje się to za pośrednictwem mechanizmu zależnego od •NO.

Metodologia

Uwalnianie komórek macierzystych u ludzi wystawionych na działanie HBO₂ . Protokół ten został zatwierdzony przez Instytucyjną Komisję Rewizyjną oraz Naukowy Komitet Monitorujący Badania Kliniczne w Centrum Walki z Rakiem im. Abramsona. Pacjenci odesłani zostali do Instytutu Medycyny Środowiskowej w Uniwersytecie w Pensylwanii na zabiegi profilaktyczne HBO ₂ z powodu ryzyka ORN. Gdyba tych pacjentów wyraziła zgodę na pobranie od nich krwi przed i po pierwszym, dziesiątym i dwudziestym zabiegu HBO ₂ (2.0 ATA O2 przez 2 godziny). Wszyscy ci pacjenci wcześniej poddani zostali radioterapii na nowotwory głowy i szyi; żaden pacjent nie wykazywał otwartych owrzodzeń, nie przyjmował także kortykosteroidów ani środków chemioterapeutycznych. Na podstawie obowiązującego standardu opieki, poddani zostali zabiegowi HBO ₂ przed operacją szczękową z uwagi na zespół suchości jamy ustnej i próchnicę. Mężczyźni (n = 18) charakteryzowali się wiekiem średnio 56±2 (SE), zaś kobiety (n = 8) 53±4. Uczestnicy sanitarni wewnątrz komory, mężczyźni ze średnią wieku 48±3 także oddali krew przed i po wprowadzeniu ciśnienia do 2,0 ATA na 2 godziny. Osoby te stanowiły grupę kontrolną do zbadania efektów ciśnienia względem hiperoksji, ponieważ wewnątrz komory hiperbarycznej oddychali powietrzem, nie czystym tlenem. Trzy zdrowe osoby, dwaj mężczyźni i jednak kobieta, ze średnią wieku 53±3, także przeszły dwugodzinne wystawienie na działanie hiperoksji.

Krew poddana zabiegom przeciwzakrzepowym cytrynianem (16ml) odwirowana została w Histopaque 1077 (Sigma) przy 400gprzez 30 minut celem odizolowania leukocytów, zaś komórki wypłukano w PBS. Gdzie było to konieczne, wyizolowane leukocyty poddano dalszej puryfikacji celem pozyskania komórek CD34⁺ oraz CD34^– za pomocą paramagnetycznych perełek polistyrenu powleczonych przeciwciałami CD34 (Dynal Biotech, Lake Success, NY). Izolaję przeprowadzono sokładnie wedle zaleceń producenta z jednym wyjątkiem – gdy komórki były przytwierdzone do perełek, przemyto je tylko dwukrotnie, nie trzykrotnie. Zazwyczaj system doboru perełek osiąga 90% czystości komórek wykazujących CD34, jednak odzyskuje jedynie ~50% wszystkich komórek CD34⁺ z zawiesiny komórkowej. Naszym celem było osobne określenie potencjału do wzrostu komórek CD34⁺ oraz CD34^– . Za pomocą naszej zmodyfikowanej metody separacji, aspirowane komórki, które nie zostały przytwierdzone do perełek pokrytych antyciałami CD34 zawierały jedynie 1,4±0,4% (SE, n = 9) komórek wyrażających CD34 w całkowitej populacji monocytów, zaś odzyskane komórki odciągnięte od perełek były czyste w 75±4%. Oznacza to, że ~25% monocytów wykorzystanych w kulturach „CD34⁺ ” nie wyrażało CD34.

Względem analizy cytometrii przepływowej, przemyte monocyty zawieszono w 250 µl PBS + 0,5% BSA. Komórki najpierw poddano inkubacji z króliczymi IgG (250 µg/ml) na 5 minut w temperaturze 4^o C celem zablokowania receptorów Fc, po czym poddano je inkubacji z nasyconą koncentracją sprzężonych z R-fikoerytryną (RPE) mysich przeciwciał przeciwko ludzkiemu CD34 (Klon 581, klasa III CD34 epitop; BD Pharmingen, San Jose, CA), sprzężonych z izotiocyjanianem fluoresceinowym (FITC) mysich przeciwciał przeciwko ludzkiemu CXCR34 (R and D Systems, Minneapolis, MN) oraz sprzężonych z allofikocyjaniną (APC) mysich przeciwciał przeciwko ludzkiemu receptorowi czynnika-2 wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGFR-2) (R and D Systems) lub sprzężonych z APC CD133 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) przez 30 minut w temperaturze 4^o C. Immunoglobulina mysia dopasowana do izotopu pełniła funkcję kontrolną. Komórki następnie wypłukano w PBS, a pozostałe erytrocyty zlizowano drogą inkubacji w 155 mM chlorku amonowego, 0,1 mM EDTA oraz 10 nM węglanu sodowego (pH 7,2), odwirowano i ponownie zawieszono w PBS. Cytometrię przepływową przeprowadzono z wykorzystaniem cytometru przepływowego FACScan (Becton Dickinson) w Centralnej Placówce Cytometrii Przepływowej Centrum Walki z Rakiem im. Abramsona. Monocyty przefiltrowano na bazie przedniego i bocznego rozproszenia światła laserowego, a 100,000 przefiltrowanych komórek przeanalizowano pod kątem ekspresji markerów powierzchni komórek, które mogą występować na SPC.

Względem testów komórek tworzących kolonie (CFC), monocyty wypłukano, a następnie zawieszono w pożywce badawczej kolonii Metho-Cult (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Kanada),zwierającej metylocelulozę, L-glutaminę, płodową surowicą bydlęcą, albuminę surowicy bydlęcej, rekombinowany ludzki czynnik wzrostu komórek macierzystych, czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów, interleukinę-3 (IL-3)​​, i erytropoetynę. Kultury zapoczątkowano za pomocą 1ml zawiesiny/dołek w płytce dołkowej Petriego i inkubowano w temperaturze 37^o C, powietrzu z 5% CO₂ , w pełni wilgotnej atmosferze. Niewybrane monocyty hodowano w stężeniu 100,000 komórek na płytkę, zaś wyizolowane komórki CD34⁺ hodowano w stężeniu 50,000 komórek na płytkę. Kolonie były widoczne i policzono je za pomocą odwróconego mikroskopu na stoliku w 14 dni.

Fenotyp komórek potomnych z płytek CFC przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej. Komórki na płytkach CFC zebrano najpierw poprzez mieszanie 5 ml PBS + 0,5 mM EDTA z półmiękką pożywką Metho-Cult na płytkach, a następnie poprzez konfigurację przy 500gprzez 5 minut. Osad komórkowy wypłukano raz w PBS + 0,5% BSA, zaś jedną próbkę komórkową scharakteryzowano droga opisanej wyżej cytometrii. Druga próbka komórkowa została ponownie zawieszona w pożywce wzrostowej i hodowana w płytce 24-dołkowej. Komórki zawieszono w 60% w modyfikowanej pożywce Eagle’a opracowanej przez Dulbecco (niski poziom glukozy; GIBCO BRL, Rockford, MD), 40% pożywce MCBD-201 (Sigma, St. Louis, MO) oraz następujących suplementach (wszystkie zakupiono od firmy Sigma): 1x insulina-transferyna-selenu, kwas linolenowy-BSA, 10^-9 Deksametazonu M, 10^-4 kwasu askorbinowyego-2-fosforanu M, 100 U penicyliny i 1000 U streptomycyny.Po wzroście do konfluencji, komórki zgarnięto z płytek, przepłukano w PBS i umieszczono na płytkach mikroskopowych powleczonych polilizyną. Komórki unieruchomiono w 10% paraformaldehydzie na 10 minut i zablokowano na godzinę w temperaturze 4^o C za pomocą soli fizjologicznej buforowanej Tris (pH 8,3) zawierającej 10 mM Tris, 250 mM NaCl, 0,3% Tween 20 oraz 1% BSA. Komórki pokryto następnie 50 µl 1:1,000 rozcieńczonym czynnikiem von Willebranda mysich przeciwciał przeciwko-ludzkich (BD Pharmingen) tworzonym w PBS + 0,5% BSA przez godzinę w temperaturze 4^o C, wypłukanym dwukrotnie w PBS, a następnie przeciwbarwionym przez godzinę w temperaturze 4^o C za pomocą 1:2,500 rozcieńczonych przeciwciał przeciwko-mysich sprzężonych z Cy3 oraz aglutyniną Ulex europaeus sprzężoną z FITC (Sigma). Komórki zbadano za pomocą Bio-Rad Radiance 2000 przytwierdzonego do odwróconego mikroskopu konfokalnego na stoliku Nikon TE 300, obsługiwanego za pomocą czerwonego lasera diodowego przy 638 nm oraz laseru kryptonowego przy 488 i 543 nm.

Badania myszy.

Myszy dzikie oraz osobniki bez syntazy śródbłonka •NO (eNOS KO) (Mus musculus) zakupiono (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), karmiono standardową dietą dla gryzoni i pojono wodą ad libitum oraz przechowywano w pomieszczeniach dla zwierząt Uniwersytetu w Pensylwanii. Myszy wystawiono na 90 minutowe działanie HBO₂ po naszym opublikowanym protokole (27, 28). W wybranych badaniach, myszy dzikie potraktowano wstępnie dootrzewnowo esterem metylowym N^G -nitro-_L -argininy (_L -NAME), 40 mg/kg, przez 2 godziny przed wytworzeniem ciśnienia. Krew pobrano od znieczulonych myszy [dootrzewnowe podanie ketaminy (100 mg / kg) i ksylazyny (10 mg / kg)] ukłuciem w aortę, zaś szpik kostny pobrano przycinając koniec kości udowej i płucząc jamę szpikową za pomocą 1 ml PBS. Leukocyty odizolowano za pomocą procedury praktycznie tej samej, która opisana została wyżej względem ludzkich komórek, lecz tutaj krwinki odwirowano za pomocą Histopaque 1083 (Sigma).Barwienie przeciwciałami markerów powierzchni komórkowej przeprowadzono tak, jak zostało to opisane wyżej za pomocą sprzężonych z FITC antygenów-1 szczurzych przeciw-mysich komórek macierzystych (Sca-1) oraz sprzężonych z RPE szczurzych przeciw-mysich CD34 (w obu przypadkach BD Pharmingen). Czynnik mysich komórek macierzystych odmierzono za pomocą zestawu immunologicznego Quantikine M od firmy R and D Systems, zgodnie z wytycznymi producenta.

Poziom •NO szpiku kostnego zmierzono poprzez umieszczenie mikroelektrod wybierających •NO do jamy szpikowej dystalnej kości udowej. Myszy znieczulono, kości udowe przygotowano do procedury, a za pomocą igły numer 25 wywiercono dziurę przez kość korową. Mikroelektrody •NO pokryte nafionem, wyprodukowane z mikropipet ze szkła ołowiowego, jak opisano to we wcześniejszej publikacji (33), umieszczono w jakie i utrzymano w miejscu za pomocą zespołu ramienia mikromanipulatora. Myszy umieszczono następnie w komorze hiperbarycznej celem wystawienia na działanie HBO₂ . W wybranych badaniach, przy wdychaniu jedynie powietrza, nie HBO₂ , myszy otrzymały dootrzewnowo dawkę nitroprusydku sodu (4–8 mg/kg) celem oceny, czy manipulacja ta zmieni stężenie •NO szpiku kostnego i zmobilizuje SPC.

Statystyki

Analiza statystyczna liczebności ludzkich komórek macierzystych przeprowadzona została drogą powtarzalnych pomiarów ANOVA, a następnie testu Dunnetta (SigmaSTAT, Jandel Scientific). CFC przed i po hiperoksji przeanalizowano za pomocą testu- t, zaś mobilizacja mysich komórek macierzystych przeprowadzona została za pomocą ANOVA, a następnie za pomocą testu Dunnetta. Poziom znamienności przyjęto jako P<0,05,a wyniki wyrażono jako wartości średnie ± SE.

Wyniki

Mobilizacja SPC u ludzi. Krew od pacjentów pobrana została przed i po ich pierwszym, dziesiątym i dwudziestym zabiegiem profilaktycznym ORN (standardowa terapia przedoperacyjna składa się na 20 zabiegów). Leukocyty krwi pobrano i przeanalizowano pod kątem obecności SPC na bazie na bazie cytometrii przepływowej i CFC.

Wyniki cytometrii przepływowej wykazały różnorakie reakcje na HBO₂ , na dowód czego wyniki trzech różnych pacjentów pokazano na Ryc. 1-3 . Na Ryc. 1A widać typowy wykres rozproszonych kropek z jednej próbki komórkowej. Przed wystawieniem pacjentów na działanie HBP₂ , bardzo niewiele krwinek pozytywnie reagowało na CD34, najczęściej używany marker powierzchni komórkowej do SPC (20). Niewiele było także komórek wykazujących VEGFR-2, receptor czynnika wzrostu pochodzącego z podścieliska (CXCR4) lub inny marker powierzchni komórkowej, CD133 (20). Markery te rzadko spotkać można było także na komórkach sanitarnych uczestników w komorze hiperbarycznej, którzy pełnili w tym badaniu funkcję grupy kontrolnej efektu ciśnienia per se (np. Ryc. 1C; danych CD133 nie okazano). Porównanie Ryc. D i G wykazuje, że liczba komórek wyrażających CD34 zwiększyła się w krwi po pierwszym zabiegu HBO₂ . Po każdym zabiegu HBO₂ , odkryliśmy niewielki wzrost populacji komórek o umiarkowanie podwyższonym wyrażeniu CD34 (wykazujących natężenie między 10 i ~50) oraz innej populacji o wyższym natężeniu wynoszącym od ~100 do 1,000. Diagramy kropkowe na Ryc. 1 E oraz H wykazują wzorzec wyrażenia CD34 i VEGFR-2 przefiltrowanych komórek. Rycina 1H wykazuje populację komórek wyrażających markery powierzchniowe (górna prawa ćwiartka), zaś histogramy (Ryc. 1F oraz I) wykazują wyrażenie VEGFR-2 na komórkach przed i po pierwszym zabiegu HBO₂ u pacjenta. U wszystkich 26 pacjentów okazało się, że większość komórek CD34⁺ o wysokim natężeniu wykazywała także VEGFR-2 o natężeniu między 10 i 100.

Na Ryc. 2 widać reakcje u pacjentów przed i po ich dziesiątym zabiegu HBO₂ . Ekspresja komórek CD34 wzrosła przed dziesiątym zabiegiem, co zostanie głębiej omówione dalej w pracy (patrz Ryc. 4). PopulacjaCD34⁺ u tego pacjenta wykazywała poniekąd niższą ekspresję powierzchniową (natężenie ~100), niż u pacjentów widocznych na Ryc. 1 i 3, co zaobserwowaliśmy u trzech pacjentów.

Cyrkulujące komórki śródbłonkowe wykazują CD34 i mogą wykazywać VEGFR-2; co za tym idzie, by dokładniej poznać, czy HBO₂ zmobilizował SPC, zbadaliśmy także komórki pod kątem ekspresji CD133 i CXCR4. CD133 nie jest wykazywane przez komórki śródbłonkowe, zaś CXCR4 wykazywane jest przez podzbiór SPC (5, 13, 17, 20). Populację komórek wykazujących CD34 oraz CD133 zobaczyć można na Ryc. 2, A i D (prawa górna ćwiartka przed i po dziesiątym zabiegu). Histogramy ekspresji CD34 i CD133 na cyrkulujących komórkach widać także na Ryc. 2. Rycina 3 wykazuje reakcje u trzeciego pacjenta przed i po dwudziestym zabiegu HBO₂ .

Zdefiniowaliśmy komórki CD34⁺ jako cechujące się intensywnością fluorescencji powyżej 10. Jak widzimy na Ryc. 4, następowały trwałe wzrosty populacji cyrkulujących CD34⁺ po pierwszym zabiegu HBO₂ . Jednakże, liczba leukocytów w krwi obwodowej nie różniła się znacznie przed i po zabiegu HBO₂ (6.8 ± 0,3 x 103/µl, 27% mononuklearnej wstępnej ekspozycji; oraz 6.7 ± 0.8 x 103/µl, 28% mononuklearnej ekspozycji wtórnej), zgodnie z naszymi wcześniejszymi obserwacjami (35). Ułamek komórek CD34⁺ w przefiltrowanej populacji wynosił 0.20 ± 0,05% (SE) przed pierwszym zabiegiem HBO₂ oraz 1.58 ± 0,27% po dwudziestym zabiegu HBO₂ , wzrost ośmiokrotny. Mobilizacja SPC wywołana była ekspozycją na hiperoksję, nie tylko ciśnienie, ponieważ nie zauważono wzrostu cyrkulujących komórek CD34⁺ u trzech uczestników sanitarnych, którzy pomagali pacjentom wewnątrz komory hiperbarycznej (wdychali powietrze, nie czysty tlen, przy 2,0 ATA). Na Ryc. 1C widać próbkę komórkową pobraną po tym, jak pierwszy uczestnik medyczny przeszedł proces produkcji ciśnienia, a populacja CD34⁺ wyglądała podobnie do tej na Ryc. 1 D oraz E.

Liczba komórek wykazujących CD34 znacznie się zwiększyła między pierwszym i dziesiątym zabiegiem. Pojawił się trend zmierzający ku dalszemu wzrostowi (nieznacznemu) między dziesiątym i dwudziestym zabiegiem. Chociaż liczba komórek CD34⁺ nie była znacząco różna przed i po dziesiątym i dwudziestym zabiegu, do dwudziestego zabiegu podgrupa komórek CD34⁺ wykazujących takżeCXCR4 była znacznie większa w porównaniu z dualnie pozytywną populacją przed zabiegiem HBO₂ . Wyniki te widać na Ryc. 5.

Cyrkulujące SPC zmierzono także u trzech ludzi przed i po pojedynczej dwugodzinnej ekspozycji na 1 lub 2 ATA O₂ . Nie było znacznej zmiany w cyrkulujących SPC w wyniku ekspozycji na 1 ATA O₂ (danych nie pokazano), lecz odkryliśmy trzykrotny wzrost w wyniku ekspozycji na 2 ATA O₂ , co było znacznie solidniejszą reakcją na pojedyncza ekspozycję na HBO₂ od tej zaobserwowanej w populacji u pacjentów opisanych na Ryc. 4. Przed ekspozycją na 2,0 ATA O₂ , średni ułamek komórek CD34⁺ wynosił 0,20 ± 0,02%, a później na hiperoksję przy 2 ATA O₂ , średni ułamek komórek CD34⁺ wynosił 0,67 ± 0,03% (P < 0,05).

Alternatywnym podejściem do oceny SPC było określenie liczby CFC w krwi obwodowej. Jak widzimy na Ryc. 6, CFC uległy znacznemu wzrostowi w reakcji na pojedynczą ekspozycję na HBO₂ . Warto zauważyć, że nie odkryliśmy wzrostu CFC przed dziesiątym i dwudziestym zabiegiem, chociaż liczba komórek CD34⁺ zwiększyła się (Ryc. 4). Ponieważ próby te przeprowadzono w niewybranych monocytach, przeprowadzono serię prób po separacji monocytów wykazujących CD34 z wykorzystaniem perełek paramagnetycznych pokrytych przeciwciałami CD34 (patrz METODOLOGIA). Procedurę tę przeprowadzono na komórkach pobranych od 10 pacjentów przed i po dwudziestym zabiegu HBO₂ . Spodziewaliśmy się lepszego wzrostu we wzbogaconej populacji, więc komórki umieszczono na płytkach w mniejszym zagęszczeniu, 50,000 na płytkę, dla porównania na Ryc. 6 widać 100,000 na płytkę. Przed zabiegiem było 12±1 kolonii na płytkę, zaś po HBO₂ , wzrosły 23±2 kolonie (P < 0,005), z kolei w ułamku ujemnym CD34, wzrosło 11±1 kolonii na płytkę przed zabiegiem, a po HBO₂ 11±1 kolonii na płytkę (brak znacznej różnicy).

Fenotyp komórek potomnych od 14 pacjentów przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki zebrano i ceniono wykazywanie CXCR4 i VEGFR-2. Na Ryc. 7 widać typowy wzorzec ekspresji, nie zauważyliśmy w niej dostrzegalnej różnicy, nieważne czy komórki hodowane były po pierwszy, dziesiątym, czy dwudziestym zabiegu HBO₂ . Komórki pochodne hodowano także i zbadano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jakieś 10% w znacznym stopniu wykazywało czynnik von Willebranda i barwiły się pozytywnie dla lektyny Ulex europaeus, sugerując, że podzbiór zmobilizowanych SPC to śródbłonkowe progenitory.

Badani na myszach. SPC w krwi obwodowej u myszy oceniono jako komórki o koekspresji CD34 i Sca-1. W testach wstępnych odkryliśmy, że najskuteczniejsze ciśnienie do zwiększania SPC u myszy wynosi 2,8 ATA O ₂ . Ekspozycja na 100% O ₂ pod ciśnieniem atmosferycznym oraz ekspozycja na kontrolę ciśnienia, 2,8 ATA za pomocą gazu zawierającego 7,5% O ₂ (więc ciśnienie cząstkowe O₂ było takie samo, jak powietrze otoczenia, 0,21 ATA O ₂ ), nie stymulowała mobilizacji SPC (Ryc. 8). Jeśli leukocyty zebrano natychmiast po ekspozycji na HBO ₂ , nastąpił znaczny wzrost komórek CD34⁺ /Sca-1⁺ (Ryc. 8).

Istnieje precedens szybkiej mobilizacji komórek macierzystych ze szpiku kostnego, lecz uważa się, że najintensywniejsza emigracja następuje po okresie proliferacji komórkowej w niszy szpiku (16, 22). Odkryliśmy, że liczba cyrkulujących SPC była największa 16 godzin po wystawieniu myszy na działanie 2,8 ATA O₂ , a jeśli myszy wystawiono na 90-minutowe działanie 2,8 ATA O₂ dwa dni pod rząd, liczba ta zwiększyła się jeszcze bardziej (Ryc. 8). Nie odnotowano dodatkowego wzrostu SPC we krwi obwodowej po przeprowadzeniu na myszach więcej, niż dwóch zabiegów HBO₂ . Liczba leukocytów w krwi obwodowej i szpiku kostnym nie zwiększyła się w reakcji na HBO₂ , lecz nastąpił znaczny wzrost CFC we krwi oraz szpiku (Tabela 1). Rozpuszczany kit ligand (czynnik wzrostu komórek macierzystych, SCF) uległ znacznemu zwiększeniu w krwi obwodowej myszy wystawionych na działanie HBO₂ (Tabela 1).

Przeprowadzono serię badań celem ewaluacji tego, czy mobilizacja SPC jest reakcją związaną z •NO. Odkryliśmy, że SPC nie uległy mobilizacji w grupie myszy bez eNOS. Wystawione na działanie powietrza myszy bez eNOS wykazywały więcej komórek podwójnie dodatnich Sca-1/CD34 w przefiltrowanej populacji komórkowej, niż myszy dzikie 0,27 µ 0,05% (n = 4), jednak nie było żadnych dowodów na mobilizację komórek macierzystych w reakcji na HBO₂ . Poziom komórek 16 godzin po ekspozycji myszy z nokautem na 2,8 ATA O₂ przez 90 minut wynosił 0,26 ± 0,08% (n = 5). Odkryliśmy także, że gdy myszy dzikie otrzymały przed HBO₂ nieswoisty inhibitor syntazy NO _L -NAME, mobilizacja SPC nie nastąpiła po żadnych z trzech różnych protokołów ekspozycji na HBO₂ (Ryc. 8). Liczebność SCF krwi obwodowej nie zwiększyła się u myszy potraktowanych _L -NAME i wystawionych na działanie HBO₂ (Tabela 1).

	Grupa kontrolna	2,8 ATA O2
Monocyty krwi/µl	2,644±306	2,103±297
Leukocyty szpiku/piszczel	3.2±2.2_107	2.9±2.7_107
CFC/50,000 leukocytów krwi	2.6±0.3	4.8±1.4*
CFC/50,000 leukocytów szpiku	17.0±1.2	26.2±1.5*
SCF osocza, pg/ml	42.6±2.8	59.5±0.8*
SCF osocza (u myszy wstępnie potraktowanych L -NAME), pg/ml	39.4±1.9	42.4±2.5

Wziąwszy pod uwagę, iż •NO wydaje się być powiązany z mobilizacją SPC, zbadaliśmy, czy podanie środka zawierającego •NO może mieć efekt podobny do HBO₂ . Najpierw zbadaliśmy zmiany koncentracji •NO w szpiku kostnym wynikłych z dootrzewnego podania SNP. Rozpoczęliśmy od dawki 4mg/kg, która, jak się spodziewamy, obniża ciśnienie krwi ~25% na godzinę (31). Na Ryc. 9 widać typową reakcję oraz średnią reakcję z trzech różnych testów. Stężenie •NO osiągnęło szczyt 39± 10 nM i wróciło do poziomu bazowego 15 minut po wstrzyknięciu SNP. Ryc. 9 pokazuje także typową reakcję na HBO₂ , zgodną z nieopublikowanymi obserwacjami (Goldstein LJ, Gallagher K, Baireddy V,

Bauer SM, Bauer RJ, Buerk DG, Thom SR oraz Velazquez OC). HBO­₂ spowodował szybki wzrost •NO w szpiku kostnym, który osiągnął szczyt 1,008 ± 255 nM (n = 3), który to poziom utrzymywał się przez cały okres trwania hiperoksji. Przy nominalnym efekcie SNP na poziomie 4mg/kg, przeprowadziliśmy cztery testy z wykorzystaniem 8 mg/kg, jakieś ¾ LD₅₀ dla myszy (39). •NO w szpiku kostnym wzrósł o 38 ± 12 nM. Zbadaliśmy także cyrkulujące SPC u myszy 90 minut po podaniu SNP i odkryliśmy, że populacja podwójnie dodatnich filtrowanych komórek Sca-1/CD34 wynosiła 0,11 ± 0,02%, co nie było znaczną różnicą względem grupy kontrolnej.

Omówienie

Wyniki niniejszego badania wykazują, iż wystawienie na HBO₂ spowoduje szybką mobilizację SPC u ludzi, zaś ilość SPC pozostaje zwiększona we krwi przez okres trwania 20 zabiegów HBO₂ . Na podstawie reakcji u zdrowych ludzi w grupie kontrolnej, wydaje się, iż uprzednie wystawienie na działanie promieniowania umniejsza reakcję na zabieg HBO₂ . Powszechnie wiadomo, ze radioterapia zmniejsza mobilizację zachodzącą w reakcji na środki terapeutyczne i czynniki wzrostu (19, 25).

Badania na myszach wykazują, że HBO₂ stymuluje mobilizację SPC, chociaż reakcja na poszczególne dawki może różnić się od tej u ludzi. Nie badaliśmy systematycznie reakcji na upływ czasu lub dawkę w mobilizacji SPC przez HBO₂ u ludzi. Typowy przebieg badania naukowego/medycznego polega na tym, by przeprowadzić badania w systemach modelowych, a następnie zweryfikować odkrycia na ludziach. W naszym badaniu przeprowadziliśmy jednak wstępne obserwacje mobilizacji SPC przez HBO₂ u ludzi, a dopiero potem zbadaliśmy reakcje u zwierząt celem wyjaśnienia zachodzącego mechanizmu. Co więcej, gdybyśmy zaczęli badania od zwierząt, moglibyśmy nie dokonać naszego odkrycia, ponieważ zazwyczaj używany protokół HBO₂ (2,0 ATA O₂ przez 1-2 godziny) powoduje dość nominalny efekt u myszy. Odkryliśmy, że najskuteczniejszym ciśnieniem zwiększającym cyrkulujące SPC u myszy jest 2,8 ATA O₂ .

Obserwacje u myszy bez eNOS oraz hamującego wpływu _L -NAME u dzikich myszy wskazują, że HBO­₂ mobilizuje SPC za pomocą mechanizmu zależnego od •NO. HBO₂ podnosi liczebność SCF w krwi obwodowej, co również jest hamowane przez _L -NAME. Odkrycia te zgadzają się z opublikowaną pracą wykazująca, że stymulacja syntazy •NO szpiku kostnego aktywuje metaloproteinazę-9 do oddzielenia SCF od połączenia membranowego, pozwalając tym samym na mobilizację SPC przy pomocy SCF (1, 8). HBO₂ powoduje znaczny wzrost stężenia •NO w szpiku kostnym, którego nie można odtworzyć infuzją SNP.

U pacjentów doszło do znacznego zwiększenia liczebności komórek CD34⁺ między pierwszym i dziesiątym zabiegiem hiperbarycznym. U myszy, okazało się, że dwa zabiegi powodowały znacznie większą mobilizację, niż jeden, lecz żadne dodatkowe zabieg nie powodowały już żadnego wzrostu. Różnica między reakcjami u ludzi i myszy nie jest jasna. Może być powiązana z widocznie słabszą reakcją u pacjentów po radioterapii w porównaniu z normalną grupą kontrolną. W badaniu tym nie poddawaliśmy ludzkich ochotników na więcej, niż jeden zabieg, więc nie znamy optymalnego protokołu u normalnych, zdrowych ludzi. Alternatywna możliwość może polegać na różnicach między syntezą •NO w szpiku kostnym w reakcji na HBO₂ u ludzi i myszy.

Pojawiła się rozbieżność między liczbą komórek wykazujących CD34 oraz zaobserwowanych CFC przed dziesiątym i dwudziestym zabiegiem HBO₂ . Wyniki eksperymentów CFC przeprowadzonych z oczyszczonymi preparatami monocytów wykazujących CD34, oraz tych niewykazujących CD34, wskazują, że to populacja komórek CD34⁺ odpowiadała za wzrost CFC w reakcji na HBO₂ . Nie jest jasne, dlaczego liczebność CFC nie wzrosła w trakcie wstępnego liczenia kolonii z komórkami pobranymi przed dziesiątym i dwudziestym zabiegiem. Zwiększony wzrost po HBO₂ może być związany z niewielkim ułamkiem komórek uwolnionych w pobliżu HBO₂ , które wykazują zwiększony potencjał do wzrostu. Komórki CD34⁺ mobilizowane przez środki chemioterapeutyczne i czynniki wzrostu wykazują, wedle raportów, solidniejszy potencjał do wzrostu, niż starsze SPC w cyrkulacji. Komórki pozyskane od pacjentów po przejściu zabiegów celem mobilizacji SPC wykazują się dwukrotnie większą skutecznością pokrywania płytek (37). Nie wykluczyliśmy też możliwości, że najświeższa ekspozycja na HBO₂ może wywrzeć na SPC efekt antyapoptotyczny lub sprzyjający proliferacji.

Komórki potomne z płytek CFC wykazują CXCR4 oraz VEGFR-2. Ponieważ CXCR4 jest wymagany do przejścia komórki porogenitowej do miejsca urazu/niedokrwienia, VEGFR-2 obecny jest na progenitorach śródbłonkowych, odkrycia te sugerują, że pewne komórki mobilizowane przez HBO₂ mogą pełnić funkcję progenitorów śródbłonkowych (14, 17). Znajduje to również potwierdzenie w naszych odkryciach dokonanych za pomocą mikroskopii konfokalnej. W mysim modelu rany niedokrwiennej odkryliśmy, że HBO₂ stymuluje przejście SPC do ran niedokrwiennych, poprawia waskulogenezę i gojenie (Goldstein LJ, Gallagher K, Baireddy V, Bauer SM, Bauer RJ, Buerk DG, Thom SR oraz Velazquez OC, obserwacje nieopublikowane).

Nasze badanie zapewnia nowy wgląd w możliwe mechanizmy terapii za pomocą HBO₂ . HBO₂ stymuluje neowaskularyzację w modelach ludzi i myszy, chodź zachodzące mechanizmy nie zostały do końca zrozumiane (15, 24). Inni wykazali, że HBO₂ usprawnia syntezę czynnika wzrostu (11, 14, 26). Gdyby czynniki wzrostu zostały podniesione w ranach niedokrwiennych oraz miejscach wystawionych na działanie promieniowania, czynniki te przyciągałyby zmobilizowane SPC, kierując je na poszkodowane obszary, gdzie mogłaby zajść waskulogeneza.

W odniesieniu do wielu schorzeń i interwencji klinicznych, badane są nowe role dla zmobilizowanych SPC oraz wzrost SCF (10, 12, 21, 27, 29, 32). Wykazano, ze populacja komórek CD34⁺ /CD133^– jest pluripotencjalna, zdolna do odbudowy szpiku kostnego u napromieniowanych myszy oraz formowania progenitorów dendrytycznych (5). Badania te stanowią mobilizację dla dalszych testów HBO₂ , wziąwszy pod uwagę jego bezpieczeństwo względem obecnych metod mobilizacji SPC (6, 18, 38). Uraz ciśnieniowy słuchu zachodzi u niewielu pacjentów, a rzadkie przypadki biochemicznej toksyczności O₂ dla oczu, płuc i ośrodkowego układu nerwowego są praktycznie zawsze odwracalne (6, 18, 38). Dodatkowy obszar, gdzie ważne jest mobilizacja SPC to transplantacja szpiku kostnego (36). Ponieważ mobilizacja SPC może być różna w odpowiedzi na chemioterapię, może istnieć potencjał usprawnienia skuteczności tej procedury za pomocą ogólnego HBO₂ . Kwestia ta wymaga dodatkowych badań.